La tecnica PacBio (Pacific Biosciences) è il metodo di sequenziamento di terza generazione più utilizzato, soprattutto grazie al fatto che le reads con esso ottenute sono molto lunghe, anche maggiori di 20.000 bp. Pensate che con questa tecnica è possibile, con una sola corsa di sequenziamento, sequenziare un intero genoma batterico.

Anche in questo caso è necessario costruire una libreria prima di procedere con l’effettivo sequenziamento. Per la costruzione della libreria è necessario frammentare il DNA estratto da sequenziare, generalmente per sonicazione e, successivamente, aggiungere degli adattatori circolari alle estremità dei frammenti di DNA ottenuti. Questi prendono il nome di SMRTbell DNA.

Fig. 1 PacBio SMRTbell Template Preparation Workflow for PacBio RS II system. PacBio SMRTbell Template Preparation Workflow for PacBio RS II system. This workflow is used to prepare libraries from fragmented and concentrated DNA using Covaris g-TUBE and concentrated using the AMPure magnetic beads before following PacBio SMRTbell 10 kb Library Preparation procedures.
Fonte: Kong N, Ng W, Thao K, Agulto R, Weis A, Kim KS, Korlach J, Hickey L, Kelly L, Lappin S, Weimer BC. Automation of PacBio SMRTbell NGS library preparation for bacterial genome sequencing. Stand Genomic Sci. 2017 Mar 23;12:27. doi: 10.1186/s40793-017-0239-1. PMID: 28344744; PMCID: PMC5363030.

Dopo aver costruito la libreria si procede direttamente con il sequenziamento di questi senza passare per una fase di amplificazione o di clonaggio come abbiamo visto invece nelle tecniche di sequenziamento di seconda e prima generazione. In particolare per il loro sequenziamento i frammenti vengono caricati su di un supporto che prende il nome di SMRT cell. Questo è dotato di migliaia di nano pozzetti definiti ZMW (Zero-Mode Waveguide), i quali hanno un diametro di circa 70 nm e una profondità di 100 nm ed il volume di rilevamento è di circa 20 zeptolitri (2∙10-20 l). È importante precisare che in ciascun pozzetto ci sarà un singolo frammento della libreria. Infatti sul fondo di ciascun pozzetto è presente una molecola di DNA polimerasi alla quale si lega il frammento che verrà sequenziato.

Fig 2. Fonte: https://www.pacb.com/

Il processo di sequenziamento inizia quando si aggiungono le diverse tipologie di nucleotidi (dsNTPs) nella SMRT cell. Dato che i nucleotidi sono marcati con diverse molecole fluorescenti è possibile distinguere quale nucleotide viene aggiunto per complementarietà dalla DNA polimerasi. Infatti l’enzima DNA polimerasi, a partire da un primer di sequenziamento che si appaia all’adattatore del frammento, aggiunge un determinato tipo di nucleotide nel caso di complementarietà con i frammenti in via di sequenziamento. Nel momento in cui sta per essere aggiunto un nucleotide verrà registrato un segnale luminoso proveniente dal pozzetto relativo alla fluorescenza emessa dal fluorocromo legato al gruppo fosfato del nucleotide che è in procinto di essere aggiunto per la costruzione della sequenza. Quando poi il nucleotide viene aggiunto il gruppo fosfato viene rimosso insieme al fluorocromo, con conseguente decadimento della fluorescenza relativa a questo. Il processo di sequenziamento del frammento presente in ciascun pozzetto della SMRT cell avviene più volte grazie all’attività “scalzante” della DNA polimerasi. Ciò consente di produrre più reads da ogni singolo frammento nonostante l’assenza del processo di amplificazione.

Fig. 3 A schematic illustration representing the highly parallel optic system used in Single Molecule Real-Time (SMRT) DNA sequencing technology (Pacific Biosciences). This method uses SMRT chips that contain thousands of zero-mode waveguides (ZMWs). The presence of a fluorescent dye within the detection volume (within the ZMWs) indicates nucleotide incorporation. This leads to a light flash that is separated into a spatial array, from which the identity of the incorporated base can be determined. Fonte: Pushpendra K. Gupta,
Single-molecule DNA sequencing technologies for future genomics research, Trends in Biotechnology, Volume 26, Issue 11, 2008, Pages 602-611, ISSN 0167-7799, https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2008.07.003. (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167779908002047)

Il segnale luminoso proveniente dai pozzetti della SMRT cell viene registrato da una camera estremamente potente, posizionata sul fondo di tale supporto, e per ciascun pozzetto viene prodotto un tracciato relativo ai picchi di fluorescenza registrati in esso all’aggiunta di ciascun nucleotide (dunque per ogni nucleotide abbiamo un picco registrato). Inoltre è bene precisare che pur avendo all’interno del pozzetto tutte le tipologie di nucleotidi con le diverse molecole fluorescenti a loro legate, in realtà la camera riesce a rilevare solo la fluorescenza del nucleotide che sta per essere aggiunto dalla DNA polimerasi grazie alla sensibilità della camera e grazie al fatto che il volume di rilevamento è un volume estremamente piccolo che consente di registrare solo il segnale luminoso del nucleotide vicino al sito attivo dell’enzima.

Lo so, come al solito spiegare un processo così articolato nel dettaglio mi viene piuttosto difficile ma qui sotto ho riportato dei video che vi aiuteranno nella comprensione, presi direttamente dal canale youtube ufficiale di Pacific Biosciences (PacBio).

Ed eccoci arrivati alla fine di questo articolo. Se è stato di vostro gradimento scrivete un commento o lasciate un “mi piace”.

Ciao e a presto.