PANDORA (Panoramic RNA Display by Overcoming RNA Modification Aborted Sequencing) è un nuovo metodo di sequenziamento dell'RNA sviluppato da scienziati dell'Università della California, Riverside (UCR) e pubblicato sulla rivista Nature Cell Biology in un articolo intitolato "PANDORA-seq espande il repertorio di piccoli RNA regolatori superando le modifiche dell'RNA. "

Pandora-seq utilizza un trattamento enzimatico combinatorio per rimuovere le modifiche chiave dell'RNA che bloccano la legatura dell'adattatore e la trascrizione inversa consentendo l'identificazione di abbondanti sncRNA modificati, principalmente tsRNA e rsRNA, che in precedenza non potevano essere facilmente rilevati (Fig.1).

TsRNA (piccolo RNA derivato da tRNA) e rsRNA (piccolo RNA derivato da rRNA) hanno origine dalla scissione di tRNA e rRNA ed esistono in tutti i domini della vita, inclusi archaea, batteri ed eucarioti. La presenza e l'abbondanza relativamente elevata di tsRNA e rsRNA è stata evidenziata in molti set di dati di sequenziamento ad alto rendimento, suggerendo così il loro ruolo importante come entità biologicamente attive. Infatti, tsRNA e rsRNA sono presenti negli organismi viventi in condizioni fisiologiche e sono coinvolti nella risposta allo stress ambientale e in vari processi come la regolazione trascrizionale, il controllo dei retrotrasposoni, l'eredità epigenetica.

I complessi scenari di modifica dell'RNA che portano alla sintesi di questi piccoli RNA hanno causato problemi nei saggi ad alto rendimento in quanto interferiscono con la preparazione della libreria RNA-seq e impediscono il rilevamento di tsRNA e rsRNA recanti determinate modifiche. Questa nuova tecnica di sequenziamento dell'RNA, secondo i ricercatori che l'hanno sviluppata, consentirebbe invece di rilevare anche questi piccoli RNA originatisi in seguito a queste complesse modifiche, risolvendo i problemi di rilevamento migliorando, come accennato in precedenza, sia il binding dell'adattatore che esegue la trascrizione inversa durante la costruzione della libreria RNA-seq consentendo così la rilevazione di un numero molto maggiore di piccoli RNA.

Immagine 1. a, Schemi delle proprietà dell'RNA (modifiche terminali e interne) e passaggi chiave (legatura dell'adattatore e trascrizione inversa) di RNA-seq tradizionale, RNA-seq facilitato da AlkB, RNA-seq facilitato da T4PNK e PANDORA-seq. b, Schema delle capacità di rilevamento dei suddetti protocolli RNA-seq da un piccolo pool di RNA. c, Attività di demetilazione di m1Sono1G, m3C e m22G con o senza trattamento AlkB di frazioni di RNA da 15 a 50 nucleotidi dal tessuto di topo (fegato), come rivelato da LC-MS / MS (n = 3 campioni biologicamente indipendenti). I dati rappresentano la media ± sem La significatività statistica è stata determinata da un multiplo bilaterale t-prova (**P <0.01; ***P <0.001). d, Convalida dei miglioramenti nella legatura terminale 3 'dopo il trattamento con T4PNK in tsRNA sintetizzati e piccole frazioni di RNA estratte dal tessuto del topo (milza). nt, nucleotidi. e, Analisi Northern blot della sequenza di adattatori 3 ′ per mostrare, semiquantitativamente, un miglioramento nel numero di adattatori da legare prima e dopo il trattamento con T4PNK. f-i, Il protocollo di trattamento migliorato ha ridotto al minimo il potenziale aumento artificiale di tsRNA e rsRNA a causa della degradazione de novo di tRNA e rRNA. Nel f e g, Il trattamento con AlkB sugli RNA totali (dalle cellule HeLa) ha determinato un aumento dello tsRNA (f) e prodotti rsRNA (g), come osservato da un aumento dello striscio di RNA (a sinistra) e da Northern blot (a destra). Nel h e i, analisi Northern blot di tsRNA (h) e rsRNA (i) dopo il trattamento con AlkB e / o T4PNK su frazioni di RNA preselezionate (RNA da 15 a 50 nucleotidi da cellule HeLa) non ha prodotto un'ulteriore degradazione. Per d-i, risultati simili sono stati ottenuti in tre esperimenti indipendenti. j, Il confronto dei risultati di PANDORA-seq utilizzando il trattamento con T4PNK prima e AlkB secondo (T4PNK + AlkB) o AlkB prima e T4PNK secondo (AlkB + T4PNK) nelle cellule HeLa (da 15 a 50 nucletide RNA) ha mostrato risultati altamente coerenti ( La correlazione di Spearman; ρ = 0.995). Sono inoltre forniti coefficienti di correlazione per confronti tra altri protocolli. Dati di origine statistica, precisi P i valori e le macchie non elaborate sono forniti nei dati di origine.
Fonte: https://www.nature.com/articles/s41556-021-00652-7

Per approfondire l'argomento vi invito a leggere l'articolo che questi ricercatori hanno pubblicato su Nature per entrare nei dettagli della tecnica e capire come funziona. Puoi accedere direttamente all'articolo cliccando qui.

As Tong Zhou, a bioinformatician at the University of Nevada, Reno School of Medicine and co-author of the study, said, "PANDORA-seq has opened Pandora's box of small RNAs"

Fonte:

  • Shi, J., Zhang, Y., Tan, D. et al. PANDORA-seq espande il repertorio di piccoli RNA regolatori superando le modifiche dell'RNA. Nat Cell Biol 23 424-436 (2021); https://doi.org/10.1038/s41556-021-00652-7
  • Oberbauer, V., & Schaefer, MR (2018). Piccoli RNA derivati ​​da tRNA: biogenesi, modifica, funzione e potenziale impatto sullo sviluppo della malattia umana. Geni, 9(12), 607; https://doi.org/10.3390/genes9120607